Znaczenie białka CRBN w terapii szpiczaka mnogiego – przełomowe odkrycia

Czy wiesz, jak rozwija się terapia szpiczaka mnogiego?

Szpiczak mnogi (MM) jest nowotworem hematologicznym charakteryzującym się naciekiem monoklonalnych komórek plazmatycznych w szpiku kostnym oraz produkcją paraproteiny, co może prowadzić do objawów klinicznych i laboratoryjnych określanych jako kryteria CRAB: hiperkalcemia, niewydolność nerek (renal failure), anemia oraz uszkodzenia kości (bone lesions). W ciągu ostatnich 20 lat mediana przeżycia pacjentów z MM znacząco się poprawiła, przekraczając obecnie siedem lat. Kluczowe dla tego postępu było wprowadzenie do praktyki klinicznej inhibitorów proteasomu (PIs) oraz leków immunomodulujących (IMiDs), a także ich kombinacji z przeciwciałami monoklonalnymi, takimi jak daratumumab. Dodatkowo, przeciwciała bispecyficzne oraz terapia CAR-T stały się standardowymi metodami leczenia MM, wykazując obiecujące wyniki w badaniach klinicznych. Kombinacja lenalidomid-deksametazon (LD) została pierwotnie zatwierdzona do stosowania u pacjentów z nawrotowym/opornym MM w 2006 roku, a u nowo zdiagnozowanych pacjentów w 2015 roku. Lenalidomid jest szeroko stosowany w leczeniu pierwszej linii, jednak oporność na ten lek przy pierwszym nawrocie stanowi istotne wyzwanie terapeutyczne. Pomimo rewolucji w badaniach nad nowymi lekami, u pacjentów z MM ostatecznie dochodzi do nawrotu, co wskazuje na zdolność komórek szpiczaka do rozwijania oporności na wszystkie dostępne terapie, prowadząc do skrócenia przeżycia.

Czy CRBN to klucz do sukcesu w terapii IMiDs?

Cereblon (CRBN) został po raz pierwszy opisany przez Higginsa i wsp. w 2004 roku jako białko o masie 51 kDa, składające się z 442 aminokwasów, posiadające funkcję ATP-zależnej proteazy Lon, kodowane przez locus na chromosomie 3p. Mutacja w tym genie została powiązana z łagodnym upośledzeniem umysłowym. CRBN jest białkiem wielofunkcyjnym, obecnym w wielu narządach i zaangażowanym w liczne procesy biologiczne. W komórce znajduje się w jądrze, cytoplazmie oraz błonie komórkowej. CRBN oddziałuje z kanałami potasowymi aktywowanymi wapniem (BKCa) oraz kanałami chlorkowymi (CIC), regulując pobudliwość komórek nerwowych. Ponadto, odgrywa istotną rolę w metabolizmie komórkowym poprzez regulację kinazy białkowej aktywowanej przez AMP oraz w chorobach autoimmunologicznych poprzez regulację limfocytów T CD4. Przełomowe badanie Ito i wsp. z 2010 roku opisało CRBN jako główny cel teratogennego działania talidomidu. CRBN został zidentyfikowany jako część kompleksu E3 ligazy ubikwityny, obejmującego białko wiążące DNA-1 (DDB1), Cullin 4 (Cul4A lub Cul4B) oraz regulator Cullins 1 (RoC1), posiadającego aktywność proteolityczną.

Dalsze badania nad przeciwszpiczakowym działaniem IMiDs ujawniły dwa różne mechanizmy: szlak zależny od ubikwitynacji, w którym kluczową rolę odgrywają czynniki takie jak ikaros (IKZF1), aiolos (IKZF3), czynnik regulacyjny interferonu 4 (IRF4) oraz interleukina-2 (IL2), a także szlak niezależny od ubikwitynacji, w którym IMiDs wiążą się z kompleksem CD147-MCT1 zamiast z CRBN, hamując wzrost guza. Odkrycie mechanizmów działania CRBN w MM skłoniło badaczy do wykorzystania go w praktyce klinicznej jako biomarkera odpowiedzi na leczenie IMiDs. Badania biopsji szpiku kostnego wykazały związek między supresją CRBN a opornością na IMiDs. Obecnie oceniane są w badaniach klinicznych III fazy nowe analogi, zwane modulatorami ligazy E3 cereblonu (CELMoDs) – iberdomid i mezigdomid. Jednakże, dostępne są ograniczone dane dotyczące poziomów CRBN w surowicy pacjentów z MM.

Jakie znaczenie mają poziomy CRBN w praktyce klinicznej?

Celem niniejszego badania była analiza poziomów CRBN w surowicy pacjentów z MM leczonych kombinacją LD, jego wpływu prognostycznego oraz związku z innymi cechami klinicznymi. Badaniem objęto próbki surowicy pobrane od pacjentów leczonych LD w latach 2006-2016, z dostępnymi próbkami przy rozpoczęciu terapii LD (68 pacjentów), w momencie najlepszej odpowiedzi (BR) (59 pacjentów) oraz podczas nawrotu/oporności na LD (54 pacjentów). Mediana wieku pacjentów wynosiła 70 lat (zakres 43-90), z przewagą mężczyzn (56%) nad kobietami (44%). Najczęstszym typem immunoglobuliny był IgG (64%), następnie IgA (22%), łańcuchy lekkie (11%) oraz inne (3%). Według klasyfikacji ISS, 32% pacjentów miało stadium 1, 20% stadium 2, a 48% stadium 3. Schemat LD był stosowany jako leczenie indukcyjne u 9% pacjentów, druga linia u 39%, trzecia linia u 25%, czwarta linia u 15% oraz piąta do dziewiątej linia u 12% pacjentów. Mediana całkowitego przeżycia (OS) wynosiła 76 miesięcy (zakres 6-376), a mediana czasu do następnego leczenia (TTNT) 14 miesięcy (zakres 2-110). Co istotne, wcześniejsza ekspozycja na IMiDs nie wpływała na poziomy CRBN przy rozpoczęciu leczenia LD.

Mediana poziomów CRBN przy rozpoczęciu leczenia LD wynosiła 247 pg/ml (zakres 0-9760 pg/ml), w momencie najlepszej odpowiedzi 142,5 pg/ml (zakres 0-9940 pg/ml), a u pacjentów z nawrotem/opornością na LD 298 pg/ml (zakres 0-9840 pg/ml). W grupie kontrolnej poziomy CRBN były prawie niewykrywalne, z medianą 0 pg/ml (zakres 0-580 pg/ml). Mediana poziomów CRBN wśród pacjentów z BR wynosiła 193 pg/dl dla pacjentów opornych na LD i 113 pg/ml dla pacjentów odpowiadających na LD. Osiem z 20 zdrowych osób z grupy kontrolnej miało mierzalne poziomy CRBN w zakresie od 0 do 580 pg/ml. Poziomy CRBN u osób zdrowych były znacząco niższe w porównaniu z poziomami w surowicy przy rozpoczęciu LD (p=0,003), przy BR (p=0,012) i przy nawrocie na LD (p=0,002). Poziomy CRBN w surowicy były znacząco wyższe przy rozpoczęciu LD w porównaniu z poziomami przy BR (N=48, p=0,04). Nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy (p=0,479) między poziomami przy rozpoczęciu LD (mediana 247 pg/ml) a poziomami przy nawrocie na LD (mediana 298 pg/ml) (p=0,028). Osoby oporne na LD miały poziomy krążącego CRBN, które nie różniły się znacząco od poziomów w surowicy przy nawrocie na LD (p=0,694).

Poziomy CRBN przy rozpoczęciu leczenia LD dodatnio korelowały ze zwiększoną infiltracją szpiku kostnego (BMINF ≥60%) (r=0,268, p=0,05) oraz nieprawidłowym poziomem LDH (r=-0,486, p=0,001). Nie zaobserwowano korelacji z anemią, niewydolnością nerek, hiperkalcemią, chorobą kości, plazmocytomami, małopłytkowością ani biochemicznym nawrotem obecnym przy rozpoczęciu LD. Ponadto, wysokie poziomy CRBN w surowicy przy rozpoczęciu LD korelowały z wczesnym nawrotem (≤12 miesięcy) u pacjentów, którzy jednak dobrze odpowiedzieli na LD (≥PR) (r=-0,258, p=0,03). Poziomy CRBN w surowicy poniżej mediany przy BR korelowały z lepszą odpowiedzią na następną linię leczenia po LD (r=-0,456, p=0,025). Podwyższony poziom LDH przy BR korelował również z poziomami CRBN w surowicy przy BR na LD (r=-0,411, p=0,004).

Mediana stosunku CRBN (rozpoczęcie LD/BR na LD) wynosiła 1,37. Stosunek CRBN ≥1,37 korelował z anemią (r=-0,330, p=0,046), a stosunek CRBN ≥1 był związany z nawrotem na LD po 5 latach (r=-0,338, p=0,041). Ponadto, stosunek CRBN obliczony u pacjentów opornych na LD (0,31) lepiej przewidywał pacjentów z odpowiedzią na LD ≥PR i czas trwania odpowiedzi z silną korelacją (r=-0,875, p≤0,001), ale nie nawrót pacjentów na LD po 5 latach leczenia (r=-0,108, p=0,457). Korelacje CRBN w surowicy z charakterystyką choroby przedstawiono w tabeli 3.

Siedmioletnie przeżycie było lepsze u pacjentów z poziomami CRBN poniżej mediany w momencie rozpoczęcia LD (p=0,013) oraz podczas najlepszej odpowiedzi (p=0,032), ale nie u pacjentów z nawrotem/opornością na LD (p=0,357). Czas do następnego leczenia nie różnił się istotnie w zależności od poziomów CRBN przy rozpoczęciu LD (p=0,121) i BR na LD (p=0,074).

Czy ekspresja CRBN przewiduje odpowiedź na leczenie IMiDs?

Lenalidomid stanowi jeden z podstawowych leków w terapii MM. Ponad dekadę temu CRBN został zidentyfikowany jako białko docelowe dla IMiDs. Od tego czasu zaproponowano inne fundamentalne procesy regulacji CRBN, w tym kontrolę kompleksu E3-ligazy, izoformy genu CRBN oraz regulację epigenetyczną. Ponadto, kilka badań analizowało poziomy ekspresji CRBN w liniach komórkowych MM i próbkach szpiku kostnego w celu odkrycia potencjalnego nowego leczenia celowanego lub prognostycznego znaczenia tego komponentu. Według wiedzy autorów, jest to pierwsze badanie poziomów CRBN w surowicy pacjentów z MM leczonych LD. Wykazano, że poziomy CRBN w surowicy przy rozpoczęciu LD (p=0,003), BR (p=0,012) i nawrocie na LD (p=0,002) są znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej. Odkrycie to sugeruje, że złośliwe komórki plazmatyczne mogą przyczyniać się do krążącego CRBN. Chociaż CRBN jest przede wszystkim białkiem wewnątrzkomórkowym bez klasycznego sygnału sekrecji, jego obecność w surowicy może wynikać z pasywnego uwalniania z powodu zwiększonego obrotu komórek nowotworowych lub apoptozy, lub z aktywnego eksportu poprzez nieklasyczne mechanizmy, takie jak uwalnianie egzosomów.

Mierząc CRBN w surowicy, zaobserwowano znaczące obniżenie jego poziomów od rozpoczęcia leczenia LD do najlepszej odpowiedzi na LD. Wzrost poziomów CRBN w surowicy obserwowano, gdy u pacjenta wystąpił nawrót na LD. U pacjentów ponownie leczonych LD, CRBN pozostawał podwyższony. Według ograniczonych danych w literaturze, zmniejszona ekspresja mRNA CRBN była związana z nawrotem/opornością MM. W szczególności, w liniach komórkowych MM, ekspresja mRNA CRBN była badana po ciągłej ekspozycji przez 6 miesięcy na lenalidomid 1 mM, a także w hodowlach traktowanych sekwencyjnie 1 mM przez 2 miesiące, a następnie 10 mM lenalidomidu przez 4 miesiące. Ostatnia dawka eskalacyjna 10 mM lenalidomidu została użyta do zbadania nabywania oporności na lenalidomid, która była większa niż ta osiągana klinicznie w osoczu. W poprzednim badaniu zaobserwowano zmniejszenie ekspresji mRNA CRBN przy obu stężeniach dawki lenalidomidu.

Dodatkowo, wysoka ekspresja CRBN w szpiku kostnym (BM) była związana z korzystną odpowiedzią na leczenie IMiD. W tym kontekście, ekspresja CRBN była badana u 46 pacjentów z MM i była związana z odpowiedzią na terapię talidomidem-deksametazonem. W powyższym badaniu poziomy CRBN były zmniejszone, przechodząc od całkowitej do częściowej odpowiedzi, a pacjenci niewrażliwi na talidomid doświadczyli dalszego zmniejszenia ekspresji CRBN. Ta ostatnia grupa pacjentów była stosunkowo mała, licząc tylko 7 przypadków. Podobnie do powyższych ustaleń, inna grupa badawcza zbadała ekspresję CRBN u 49 wcześniej nieleczonych pacjentów z MM otrzymujących LD. Grupa badawcza zaobserwowała, że pacjenci ze stabilną chorobą lub postępującą chorobą mieli znacznie niższą ekspresję niż pacjenci, którzy odpowiedzieli na terapię. Bila i wsp. 2018 zbadali ekspresję genu CRBN w szpiku kostnym 77 pacjentów leczonych schematami opartymi na talidomidzie i 15 schematami opartymi na bortezomibie. U pacjentów z odpowiedzią na leczenie talidomidem zaobserwowano istotną korelację z wysoką ekspresją CRBN, głównie w grupie leczonej kombinacjami opartymi na talidomidzie, podczas gdy nie zaobserwowano jej w grupie leczonej bortezomibem. Co istotne, z tej kohorty tylko 3 pacjentów miało PD. Chociaż powyższe badania sugerują, że ekspresja CRBN jest obniżona, wielkość próby pacjentów ze stabilną lub postępującą chorobą była raczej skromna.

Niższa ekspresja genu CRBN była również obserwowana u 55 pacjentów z nawrotowym/opornym MM leczonych pomalidomid-deksametazonem.

Zgodnie z badaniami immunohistochemicznymi, Franseen i wsp. 2018 zaobserwowali znaczący spadek ekspresji CRBN w szpiku kostnym u 55 pacjentów z MM, którzy stali się oporni na lenalidomid. Co istotne, 23% z 55 pacjentów, którzy rozwinęli oporność na lenalidomid, nie miało zmiany ekspresji CRBN, a połowa z nich była pierwotnie oporna na leczenie oparte na lenalidomidzie, w porównaniu do tylko 13% pacjentów ze spadkiem ekspresji CRBN, podczas gdy nie było różnicy w wyjściowej ekspresji CRBN między pacjentami pierwotnie opornymi a pacjentami z początkową odpowiedzią na leczenie oparte na lenalidomidzie. U tych osób prawdopodobnie zaangażowane są inne wyjaśnienia oporności na lenalidomid. W innej próbie Huanga i wsp. zbadania ekspresji CRBN w MM, wykazano, że dodatnie barwienie IHC CRBN (+) było związane z odpowiedzią na leczenie LD i talidomidem-deksametazonem. Z tego badania kohortowego wyodrębniono podgrupę pacjentów (21% nawrotowy/oporny MM i 25% nowo zdiagnozowany MM), którzy nie odpowiedzieli na schematy LD i TD, pomimo ekspresji białka CRBN w komórkach szpiczaka, co sugeruje możliwość istnienia mechanizmów oporności niezwiązanych z CRBN.

Czy poziomy CRBN wpływają na rokowanie pacjentów?

W niniejszym badaniu wykazano, że pacjenci z godną uwagi odpowiedzią (≥PR) i wyższymi poziomami CRBN w surowicy doświadczają wczesnego nawrotu na LD (p=0,032). Pacjenci z MM, którzy wcześnie nawracają, budzą coraz większe obawy, ponieważ wyniki przeżycia pozostają złe, a ponadto głębokość odpowiedzi na terapię sugeruje, że wydłużone przeżycie jest związane z innymi czynnikami oprócz zakresu odpowiedzi na leczenie.

W tym kontekście, innym mechanizmem oporności na lenalidomid jest aktywacja szlaku Wnt/β-kateniny przez leczenie lenalidomidem, co wpływa na cele downstream, takie jak CCND1 i MYC. Ponadto, receptory substratów, które wiążą DDB1-CUL4 oprócz CRBN, istnieją i konkurują o wiązanie z DDB1. Tak więc, te receptory mogą być zaangażowane w różne funkcje komórkowe, w tym oporność, ale te funkcje wymagają dalszych badań. Inne rzadkie mechanizmy oporności na lenalidomid mogą obejmować mutacje punktowe i nabytą delecję genu CRBN. Mutacje missense w CRBN skutkowały różnymi poziomami funkcji, w tym całkowitą utratą dla wszystkich IMiDs, brakiem wpływu na funkcję CRBN oraz efektem zależnym od środka. W rzeczywistości, te mutacje mogą być obecne w czasie oporności na IMiDs. Sugeruje to, że niskie poziomy ekspresji genu CRBN mogą być wyjaśnione faktem, że metody oparte na PCR nie identyfikują tych zmutowanych alleli.

W obecnym badaniu poziomy CRBN powyżej mediany korelowały z niekorzystnym rokowaniem u pacjentów z MM leczonych LD, i choć nieoczekiwane, może to być wyjaśnione mechanizmami uwalniania białka do surowicy. Badano białko, które zostało uwolnione z komórek i krąży swobodnie we krwi. To samo zaobserwowano dla innych czynników rozpuszczalnych, na przykład białka syndekanu-1, którego wysoka ekspresja koreluje z lepszym rokowaniem niż niska ekspresja. Przeciwnie, wysokie rozpuszczalne poziomy syndekanu-1 wiążą się z gorszym rokowaniem. Rzeczywiście, białka podążają kilkoma drogami uwalniania poprzez klasyczne szlaki wydzielnicze i inne niekonwencjonalne szlaki (rozszczepienie białka) lub poprzez egzocytozę. Pomimo faktu, że CRBN został znaleziony w jądrze, cytoplazmie i błonie obwodowej licznych komórek tkankowych, konkretna metoda uwalniania z komórki nie została jeszcze określona. W rzeczywistości, w opornych liniach komórkowych MM, produkcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i zdolności adhezyjne były znacznie wyższe niż w komórkach MM wrażliwych na lenalidomid, jak wykazali Yamamoto i wsp. Również alternatywny splicing mRNA CRBN w MM produkuje kilka izoform, z których niektóre mogą nie być nawet translatowane. Ponadto, udokumentowano przypadki wysokiej ekspresji cereblonu u pacjentów z nabytą opornością na IMiDs, podtrzymując hipotezę oporności na leki z więcej niż jednym etapem; w tym przypadku, downregulacja CRBN może reprezentować wtórne zjawisko “pasażera”.

Wyższe poziomy CRBN w surowicy były związane z BMINF (≥60%) (r=0,265, p=0,05). Poziomy CRBN w surowicy były również podwyższone u pacjentów z wysokim LDH (r=0,486, p=0,001), markerem wysokiego obciążenia guza i agresywnej choroby. Podczas gdy LDH służy jako ogólny biomarker prognostyczny w MM, CRBN w surowicy może dostarczyć dodatkowego, specyficznego dla terapii wglądu, szczególnie w kontekście leczenia opartego na IMiD. Jako molekularny cel IMiDs, CRBN jest mechanistycznie powiązany z odpowiedzią na leczenie, w przeciwieństwie do LDH. Tak więc, CRBN w surowicy może odzwierciedlać zarówno aktywność choroby, jak i wrażliwość na IMiDs, oferując komplementarną wartość prognostyczną.

Z dostępnych danych w próbkach szpiku kostnego, ekspresja CRBN odwrotnie korelowała z (ISS), beta-2-mikroglobuliną w surowicy (B2M) i albuminą w surowicy, podczas gdy inne badanie zaobserwowało, że zwiększone poziomy ekspresji CRBN były związane z wyższym B2M (r=0,66, p=0,001) u nowo zdiagnozowanych pacjentów z MM. Dodatkowo, analiza wykazała, że wyższy stosunek CRBN w surowicy między rozpoczęciem LD a BR (≥1,37) był istotnie związany z anemią i wcześniejszym nawrotem na LD, sugerując, że wzrost krążącego CRBN może odzwierciedlać progresję choroby lub stres guza. Co ciekawe, podczas gdy stosunek ≥1 był słabo związany z nawrotem po 5 latach, używając jako punktu odcięcia mediany wartości stosunku CRBN rozpoczęcia LD/BR obliczonego tylko z pacjentów opornych na LD (mediana stosunku CRBN rozpoczęcia LD/BR; 0,31) wykazało silną korelację dla odpowiedzi (≥PR) i nawrotu w ciągu 12 miesięcy (r=-0,875, p<0,001), wskazując na jego potencjał jako dynamicznego biomarkera wyników leczenia.

W kontekście wyników przeżycia, istnieją sprzeczne ustalenia dotyczące wartości prognostycznej ekspresji CRBN. Pomimo doniesień wskazujących na istotną korelację między wysokimi poziomami ekspresji CRBN w szpiku kostnym a zwiększonym PFS, nie zostało to potwierdzone w OS nowo zdiagnozowanych lub nawrotowych/opornych pacjentów z MM poddawanych IMiDS, przy czym niektórzy badacze potwierdzają związek, a inni nie donoszą o żadnym związku. Dodatkowo, wpływ ekspresji CRBN na OS został wyeliminowany, gdy uwzględniono ISS i cytogenetykę. W niedawnym badaniu, pacjenci z wysoką ekspresją CRBN w szpiku kostnym otrzymujący terapię opartą na IMiD wykazali poprawę PFS i OS w porównaniu do pacjentów otrzymujących terapię opartą na inhibitorach proteasomu. Wskazuje to, że ekspresja CRBN jest szczególnie istotna dla mechanizmu działania IMiDs, które polegają na CRBN, aby wywrzeć swoje działanie przeciwszpiczakowe. IMiDs wiążą się z CRBN i przekierowują jego aktywność ligazy E3 ubikwityny do degradacji kluczowych czynników transkrypcyjnych (np. IKZF1/3), prowadząc do śmierci komórek szpiczaka. Dlatego wysoka ekspresja CRBN zwiększa skuteczność IMiDs, podczas gdy jej poziom nie jest funkcjonalnie istotny u pacjentów otrzymujących leki niecelujące w CRBN, takie jak inhibitory proteasomu. Wyniki wyżej wymienionych badań są podsumowane w tabeli 4.

Jak mierzymy CRBN i jakie są perspektywy badawcze?

Zaobserwowano, że siedmioletnie przeżycie po leczeniu LD było lepsze u pacjentów z poziomami CRBN poniżej mediany w momencie rozpoczęcia LD (p=0,013) i podczas najlepszej odpowiedzi (p=0,032). Chociaż TTNT był rzeczywiście dość wartościowy, ponad 14 miesięcy (zakres, 2-110) w badaniu, poziomy CRBN nie różniły się istotnie między pacjentami.

Chociaż wyniki sugerują, że poziomy CRBN w surowicy przy rozpoczęciu LD i przy BR mogą pomóc przewidzieć czas trwania odpowiedzi i kierować decyzjami dotyczącymi leczenia, należy uznać kilka ograniczeń. Większość pacjentów obecnie otrzymuje lenalidomid w połączeniu z inhibitorami proteasomu lub przeciwciałami monoklonalnymi, zarówno w pierwszej linii, jak i w nawrotach. Nie jest jasne, czy wartość prognostyczna CRBN w surowicy jest zachowana w tych schematach kombinacyjnych, lub czy takie kombinacje mogą przezwyciężyć negatywny wpływ wysokich poziomów CRBN. Dodatkowo, potrzebne są dalsze badania, aby określić, czy poziomy CRBN przy nawrocie przewidują odpowiedź na kolejne terapie, takie jak pomalidomid. Te aspekty wymagają prospektywnej walidacji w większych, różnorodnych pod względem leczenia kohortach.

W badaniu uczestniczyło łącznie 92 nowo zdiagnozowanych i nawrotowych/opornych pacjentów z MM z naszej jednostki. Pacjenci byli włączeni do badania od rozpoczęcia LD do ostatniej obserwacji lub zgonu. Dokumentacja medyczna została przeanalizowana po uzyskaniu świadomej zgody pacjentów. Zebrano i przechowywano do analizy statystycznej dane kliniczne i wyniki badań laboratoryjnych, takie jak hemoglobina (Hb), kreatynina (Cr), wapń (Ca), poziomy paraproteiny (Ig), poziomy wolnych łańcuchów lekkich (FLCs), stosunek wolnych łańcuchów lekkich w surowicy (FLCR), dehydrogenaza mleczanowa (LDH), infiltracja szpiku kostnego (BMINF), B2-mikroglobulina (B2M) i albumina (alb). Wszyscy pacjenci zostali sklasyfikowani zgodnie z międzynarodowym systemem stadiowania (ISS), a ocena odpowiedzi klinicznej opierała się na kryteriach międzynarodowej grupy roboczej ds. szpiczaka (IMWG). Surowica pacjentów została pobrana, zamrożona i retrospektywnie przeanalizowana. Przebadano również próbki surowicy od dwudziestu zdrowych osób. CRBN mierzono w różnych punktach czasowych. W szczególności, CRBN mierzono przy (1) rozpoczęciu leczenia LD (68 pacjentów), (2) ocenie najlepszej odpowiedzi, w tym u pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na LD (59 pacjentów) oraz (3) nawrocie/oporności na schemat LD (54 pacjentów). Wszyscy pacjenci byli oceniani za pomocą rozmazu krwi i badań laboratoryjnych w powyższych punktach czasowych. Pięćdziesięciu czterech pacjentów z dostępnymi danymi we wszystkich punktach czasowych zostało poddanych dalszej analizie statystycznej między tymi trzema okresami. Piętnastu pacjentów było opornych na LD, podczas gdy czterdziestu czterech pacjentów z mierzalnym CRBN przy BR odpowiedziało na terapię. Aby określić wpływ zmiany poziomów CRBN w surowicy od rozpoczęcia LD do BR, obliczono stosunek (CRBN rozpoczęcie LD/BR na LD). Mediana poziomów CRBN w surowicy w każdym punkcie czasowym (rozpoczęcie LD, BR i nawrót na LD) została użyta jako punkt odcięcia do analizy przeżycia.

CRBN mierzono za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów ELISA (Cloud-Clone Corp), zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, surowica pacjentów i HI, a także standardy dostarczone przez producenta, zostały dodane do odpowiednich dołków 96-dołkowej mikropłytki pokrytej przeciwciałem specyficznym dla CRBN. Następnie do każdego dołka mikropłytki dodano awidynę sprzężoną z peroksydazą chrzanową (HRP) i inkubowano. Po dodaniu roztworu substratu TMB, reakcja enzym-substrat spowodowała zmianę koloru dołków zawierających CRBN, przeciwciało sprzężone z biotyną i awidynę sprzężoną z enzymem. Reakcję zakończono przez dodanie roztworu kwasu siarkowego, a zmianę koloru zmierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm ± 10 nm. Oprogramowanie Plot zostało użyte do skonstruowania wykresu log-log (krzywej standardowej) ze stężeniem CRBN na osi y i absorbancją na osi x. Stężenie CRBN w próbkach zostało następnie określone przez porównanie O.D. próbek z krzywą standardową. Liczba zero (0) została arbitralnie użyta do prezentacji niewykrywalnych wartości.

Do analizy statystycznej zastosowano statystyki opisowe dla zmiennych ciągłych, a zmienne kategoryczne przedstawiono jako częstości. Zmienne nieparametryczne porównano testem U Manna-Whitneya. Korelacje między parametrami klinicznymi pacjentów z MM a CRBN obliczono za pomocą metody korelacji Spearmana (r). Krzywe Kaplana-Meiera wykreślono dla całkowitego przeżycia (OS) i czasu do następnego leczenia (TTNT) według poziomów CRBN pacjentów, a następnie porównano testem log-rank. Mediana została wybrana jako punkt odcięcia do analizy statystycznej. Wszystkie wyżej wymienione testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS v28.0, a wartości niższe niż 0,05 uznano za statystycznie istotne.

Podsumowując, wykazano, że CRBN w surowicy, jako białko docelowe IMiDs, było związane z cechami choroby, przeżyciem u pacjentów z MM leczonych lenalidomidem oraz wrażliwością na terapię, co czyni to białko kluczowym dla pacjentów z MM otrzymujących lenalidomid. Zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw fluktuacji tego białka w odpowiedzi na terapię IMiD może utorować drogę dla przyszłych decyzji dotyczących leczenia.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie poziomów białka CRBN (cereblonu) w surowicy pacjentów ze szpiczakiem mnogim leczonych kombinacją lenalidomidu z deksametazonem. CRBN jest kluczowym białkiem dla skuteczności leków immunomodulujących (IMiDs). Wykazano, że poziomy CRBN w surowicy są znacząco wyższe u pacjentów ze szpiczakiem w porównaniu do grupy kontrolnej, a ich wartości zmieniają się w trakcie terapii. Niższe poziomy CRBN przy rozpoczęciu leczenia i w momencie najlepszej odpowiedzi wiązały się z lepszym rokowaniem. Wysokie poziomy CRBN korelowały z większą infiltracją szpiku kostnego i podwyższonym LDH, wskazując na związek z zaawansowaniem choroby. Badanie sugeruje, że poziomy CRBN w surowicy mogą służyć jako biomarker odpowiedzi na leczenie i wskaźnik prognostyczny u pacjentów leczonych IMiDs, choć konieczne są dalsze badania na większych grupach pacjentów.